Hiện nay, α-amylase là một trong những enzyme được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi thú y, chẩn đoán bệnh…Trong công nghiệp thực phẩm, α-amylase đóng vai trò đặc biệt quan trọng.
Thông qua sự thủy phân tinh bột, α-amylase tạo ra những sản phẩm có giá trị dinh dưỡng như dextrin, maltose, glucose…
Trước đây, người ta thu nhận α-amylase từ malt là chủ yếu. Ngày nay, với nền công nghiệp phát triển mạnh kéo theo nhu cầu về α-amylase tăng cao nên việc áp dụng những kỹ thuật tiến bộ trong nuôi cấy vi sinh vật để thu dễ dàng hơn với lượng lớn α-amylase là rất cần thiết.
Dextrin là sản phẩm do sự thủy phân tinh bột của α-amylase. Ngoài giá trị dinh dưỡng, dextrin còn là một trong những yếu tố cải thiện tính chất, cảm quan của thực phẩm. Vì vậy, dextrin ngày càng được sử dụng phổ biến trong chế biến thực
phẩm và công nghiệp bánh kẹo.
Sản xuất dextrin từ tinh bột có thể dùng acid hay enzyme. Tuy nhiên, sản xuất dextrin bằng acid có rất nhiều hạn chế là khó định hướng sản phẩm do tác dụng không đặc hiệu của acid lên nguyên liệu, độc hại nên đòi hỏi phải có trang thiết bị đắt tiền, lượng acid dư gây hư hỏng thiết bị và làm ô nhiễm môi trường. Mặc khác, dextrin thành phẩm có màu và vị đắng.
Việc sử dụng α-amylase thay thế cho acid trong các qui trình sản xuất dextrin sẽ khắc phục được những hạn chế trên.
Dextrin thu được nhờ α-amylase sau khi sấy phun có màu trắng, pH trung tính, ít ngọt, sạch khuẩn, khoáng và chất hữu cơ nên rất thích hợp sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp và trong y dược.
Từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nuôi cấy Bacillus subtilis thu nhận α-amylase và ứng dụng trong sản xuất dextrin”.
1.2. MỤC ĐÍCH
Thu nhận α-amylase, xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân của α-amylase và tinh bột để thu nhận dextrin.
1.3. YÊU CẦU
- Khảo sát thời gian nuôi cấy Bacillus subtilis trên môi trường bán rắn ở điều kiện nuôi cấy theo đề tài nghiên cứu trước.
- Thu nhận và tinh sạch sơ bộ α-amylase từ canh trường nuôi cấy B.subtilis.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thủy phân tinh bột tạo dextrin của chế phẩm α-amylase.
Chương 2
2.1. BACILLUS SUBTILIS
2.1.1. Đặc điểm vi khuẩn
Bacillus subtilis là trực khuẩn, Gram (+), có khả năng sinh catalase, hiếu khí hay kỵ khí tùy ý. Thường được tìm thấy trong đất.
Có khả năng di động, sinh nội bào tử. Tế bào sinh dưỡng có dạng hình que, kích thước chiều rộng từ 0,7 – 0,8 μm, chiều dài từ 2,0 – 3,0 μm. Không kết thành chuỗi, bắt phẩm nhuộm đồng đều, không tạo bao nang.
Bào tử B. subilis có dạng ellip đến hình cầu, kích thước chiều rộng 0,6 – 0,9 μm, chiều dài 1,0 – 1,5 μm, nằm giữa hay trong khoảng trung tâm đến gần cuối tế bào, phần lớn được tạo thành ở 48 giờ. Mỗi cá thể chỉ tạo một bào tử, bào tử có
khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn, chất hút ẩm (Trần Đỗ Quyên, 2004).
Khi nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa khuẩn lạc tròn, không đều hay phân tán. Đường kính khuẩn lạc từ 3 – 5 mm, màu vàng xám, rìa có hình răng cưa. Sau 1 – 4 ngày bề mặt khuẩn lạc nhăn nheo, màu hơi nâu (Nguyễn Đức Duy Anh, 2005).
Trong môi trường lỏng sinh khối tạo màng mỏng có lớp bao phủ. Do bào tử chiu nhiệt cao nên B. subtilis có thể gây hư hỏng một số thực phẩm hộp tạo mùi vị khó chịu.
Sinh acid từ xylose, arabinose, glucose, sucrose và mannitol nhưng không tạo khí (sử dụng nguồn nitơ là muối amonium).
Có khả năng phân giải nitrate, sinh nitrit từ nitrate. Trong điều kiện kỵ khí, không sinh khí từ môi trường lỏng chứa nitrate.
Một đặc điểm dùng để phân biệt với các vi khuẩn khác là làm tan chảy gelatine nhanh chóng.
..................
2.1.3. Bộ gen
Năm 1997, người ta đã hoàn tất việc nghiên cứu về trình tự gen của B.subtilis và lần đầu tiên công bố trình tự gen của vi khuẩn.
Bộ gen chứa 4,2 mega-base, xấp xỉ 4100 gen. Trong số đó, chỉ có 192 gen không thể thiếu được, 79 gen được dự đoán là thiết yếu. Phần lớn gen thiết yếu đều có liên quan với quá trình trao đổi chất của tế bào.
Phân loại khoa học
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: subtilis
Tên kép
Bacillus subtilis (Ehrenberg 1835 Cohn 1872)
2.1.4. Ứng dụng của Bacillus subtilis
Trong công nghiệp sản xuất amino acid, thức ăn gia súc, Bacillus subtilis là một trong những chủng vi sinh vật tổng hợp lysine có hàm lượng khá lớn (15-20%) từ tinh bột.
Trong y dược, Bacillus subtilis được đóng thành ống thuốc Subtilis 10 ml trị bệnh tiêu chảy cho trẻ em do vi khuẩn Coliform gây ra, bệnh dường ruột do lị trực trùng, đắp các vết thương lở loét ngoài da (Trần Đỗ Quyên, 2004).
Sản xuất các kháng sinh thực vật, ứng dụng trong phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae,... Người ta thấy rằng sự phát triển của Bacillus subtilis trong cây làm tăng khả năng tổng hợp các peptide kháng nấm của vi khuẩn nốt rễ (Rhizobacterium). Khả năng này được ứng dụng trong kiểm soát sinh học.
Ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic) bổ sung trong thức ăn nhằm cải thiện tiêu hóa, sức tăng trưởng; giảm sự tái phát bệnh tiêu chảy trên gia súc; bổ sung vào ao nuôi nhằm duy trì chất lượng nước ao, hạn chế bệnh cho thủy
sản nuôi.
Hệ enzyme của B. subtilis được sử dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy rửa. Chúng có thể biến đổi các dạng chất thải độc hại thành những dạng hợp chất vô hại của nitrogen, carbon dioxide, và nước.
Một chủng Bacillus subtilis được biết trước đây là Bacillus natto được dùng trong sản xuất thực phẩm thương mại của Nhật tương tự như thực phẩm cheonggukjang của Hàn Quốc.
B. subtilis tái tổ hợp được sử dụng trong sản xuất polyhydroxyalkanoates (PHA) và chúng có thể sử dụng malt phế thải như là nguồn cacbon, nhờ vậy chi phí sản xuất PHA giảm.
2.2. ALPHA-AMYLASE
2.2.1. Khái niệm
α-amylase là enzyme xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4-glucoside nằm bên trong phân tử tinh bột và glycogen.
Là một enzyme kim loại. Nếu không có sự hiện diện của ion Canxi trong phân tử enzyme sẽ không hoạt động được.
α-amylase phân cắt cacbonhydrate chuỗi dài tạo maltotriose và maltose từ amylose hay tạo maltose, glucose và dextrin từ amylopectin.
Do có thể hoạt động ở bất kỳ vị trí α-1,4 nào trên cơ chất nên hoạt động phân cắt của α-amylase nhanh hơn β-amylase. Ở động vật, α-amylase là enzyme tiêu hóa chính.
2.2.2. Phân loại, danh pháp α-amylase
α-amylase: (1,4-α-D-glucan glucanhydrolase) thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), họ 13 (GH 13), mã số EC 3.2.1.1.
Xúc tác phản ứng nội thủy phân liên kết 1,4-α-D-glucosidic trong chuỗi đường đa có chứa 3 hoặc nhiều hơn những đơn vị D-glucose liên kết với nhau ở vị trí α-1,4.
Tên khác: glycogenase; endoamylase; Taka-amylase A.
Tên hệ thống: 1,4-α-D-glucan glucanhydrolase.
2.2.3. Cấu trúc phân tử
Gồm 3 tiểu đơn vị A, B, C. A là tiểu đơn vị lõi có cấu trúc đặc trưng helix (α/β)8 – barrel, được nối với tiểu đơn vị C (C-terminal) có cấu trúc 8 đoạn β–sheet song song. Tiểu đơn vị B gồm 2 đoạn β–sheet được lồng vào giữa đoạn β–sheet thứ ba và đoạn β–helix thứ hai của tiểu đơn vị A. Tiểu đơn vị B quyết định độ bền và liên kết enzyme và cơ chất. Một ion Canxi nối giữa hai tiểu đơn vị A và B.
Tùy thuộc vào dạng enzyme mà có thể có một số tiểu đơn vị khác được gắn vào đầu C- hay đầu N- của phân tử protein.
Trung tâm hoạt động của α-amylase có chứa nhóm –COOH và -NH2 (Trần Đỗ Quyên, 2004).
Khối lượng phân tử α-amylase khác nhau ở các loài Bacillus. α-amylase vi khuẩn công nghiệp chủ yếu được sản xuất từ B. subtilis var. amyloliquefaciens và var. amylosacchariticus có trọng lượng phân tử (MW) là 49.000 dalton (Da) (theo Fisher và Stein, 1960) và 60.000 Da (Geranum, 1979). Khi có mặt Zn, enzyme sẽ liên kết tạo dạng dimer có MW 100.000 Da.
α-amylase không chứa co-enzyme, tuy nhiên nó cũng cần 1 nguyên tử gam Ca2+ cho 1 mol enzyme để ổn định cấu trúc và ngăn không cho protease phân hủy enzyme (Nguyễn Tiến Thắng, 2005).
2.2.4. Tính chất α-amylase
Tính chấy đặc trưng của α-amylase là khả năng dextrin hóa cao nên làm cho phản ứng màu của tinh bột với iod bị biến đổi nhanh chóng. Kết quả tác động của α-amylase thường làm giảm nhanh độ nhớt của hồ tinh bột do đó người ta gọi α-
amylase là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.
α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối, dung dịch đệm và rượu loãng.
α-amylase hoạt động không cần chất hoạt hóa và cần Ca với vai trò là một đồng yếu tố để xúc tác sự thủy phân tinh bột. Canxi có tác dụng ổn định tốt α-amylase trong quá trình thủy phân bằng nhiệt hay kiềm, tăng độ bền của α-amylase trước các tác nhân gây biến tính và tác dụng phân hủy của protease (Lương Đức Phẩm, 1998).
pH tối ưu của α-amylase vi khuẩn trong khoảng 6,0 – 7,0. α-amylase bị bất hoạt nhanh ở pH thấp 4,5 – 4,7 và khi có mặt các tác nhân tạo phức với Canxi như EDTA, polyphosphate, oxalate, chlorine tự do và các chất oxy hóa (Nguyễn
Tiến Thắng, 2005).
α-amylase của vi khuẩn thường bền nhiệt hơn α-amylase từ các loài vi sinh vật khác và cây trồng, chúng vẫn có thể hoạt động ở nhiệt độ mà α-amylase của nấm mốc và ngũ cốc bị bất hoạt . Nhiệt độ tối ưu của α-amylase trong khoảng 54 -
63o C (Hopek, 2006). Đối với α-amylase của Bacillus subtilis nhiệt độ tối ưu có thể đạt đến 70 - 80o C.
α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần các amino acid khác nhau, mỗi loại α-amylase được cấu tạo từ một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng.
Tuy nhiên, hàm lượng tryptophan, tyrosine thường chiếm ưu thế. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng 1/4 tổng lượng amino acid cấu thành phân tử enzyme (Trần Đỗ Quyên, 2004).
2.2.5. Cơ chế xúc tác
Phản ứng thủy phân tinh bột bởi α-amylase thường xảy ra qua hai giai đoạn
Giai đoạn đầu là giai đoạn dịch hóa: chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh.
Giai đoạn tiếp theo là sự thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa tạo thành. Nhờ đó tinh bột có thể chuyển thành maltose, glucose và các dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp, không cho màu với Iod và một ít maltose (Trần Đỗ Quyên, 2004).
2.2.6. Ứng dụng của α-amylase
Là một trong những enzyme quan trọng hiện nay do ứng dụng của nó trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm, công nghiệp dệt, chăn nuôi…
Trong công nghiệp thực phẩm:
- Sản xuất rượu, bia, nước trái cây.
- Sản xuất bánh, bánh mì: trong tinh bột tự nhiên đã có amylase của ngũ cốc nhưng hàm lượng của chúng không đủ nên việc bổ sung α-amylase có thể cải thiện tính chất của bánh như làm tăng độ nở xốp và mùi vị của bánh.
- Chế biến tinh bột, sản xuất đường maltose, syro glucose, syro fructose. Dịch giàu glucose được sử dụng trong công nghiệp sản xuất bột ngọt, công nghiệp lên men, sản xuất nước trái cây, làm mứt. Glucose tinh thể được sử dụng trong y tế, trong khẩu phần dinh dưỡng cho bệnh nhân, sản xuất dịch truyền. Syro fructose được dùng trong sản xuất đồ uống chứa ít năng lượng, bánh kẹo, nước quả và sản phẩm sữa…
Làm mềm vải trong công nghiệp dệt:
Trong sản xuất vải có giai đoạn hồ hóa làm vải chắc hơn, người ta hồ hóa bằng tinh bột. Sau khi dệt người ta phải loại bỏ chất tham gia hồ hóa bằng cách xử lý với α-amylase.
Sản xuất thức ăn gia súc giúp cải thiện tiêu hóa:
Bổ sung hỗn hợp α-amylase, cellulase, β-glucanase… vào sinh khối cỏ ủ chua nhằm tăng năng suất tiêu hóa của vật nuôi.
Bổ sung α-amylase, protease vào khẩu phần thức ăn cho heo con dưới 5 tuần tuổi nhằm gia tăng tốc độ phát triển của heo con, ngăn phát sinh bệnh tiêu chảy phổ biến ở heo con (Nguyễn Tiến Thắng, 2005).
Trong y học: chẩn đoán bệnh lâm sàng các bệnh thông thường và các bệnh thiếu enzyme.
2.3. CÁC PHưƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT SẢN XUẤT ENZYME
Công nghiệp sản xuất enzyme hiện nay trên thế giới áp dụng hai phương pháp: nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường rắn (bề mặt) có một số ưu việt hơn so với phương pháp chìm. Do lượng nước trong cơ chất thấp nên enzyme và những sản phẩm khác ở trạng thái cô đặc vì vậy dễ tinh sạch. Nuôi cấy bề mặt dễ sấy khô và ít bị tổn hao hoạt tính enzyme. Không cần trang thiết bị phức tạp, chủ yếu nuôi trên khay và buồng nuôi giữ ở nhiệt độ, độ ẩm thích hợp (Lương Đức Phẩm, 1998).
2.3.1. Nuôi cấy bề mặt
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường. Môi trường sử dụng là môi trường lỏng hoặc sử dụng môi trường đặc (môi trường bán rắn).
Ở môi trường lỏng vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường tạo thành váng khuẩn ngăn cách pha lỏng và pha khí. Vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, oxy không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme.
(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.3.2. Nuôi cấy chìm
Phương pháp này người ta sử dụng môi trường lỏng và được thực hiện trong những thùng lên men có trang bị hệ thống sục khí, khuấy trộn, điều chỉnh pH.
Phương pháp nuôi cấy chìm có ưu điểm chiếm ít diện tích nhưng có nhược điểm là dễ bị nhiễm toàn bộ và chi phí cho trang thiết bị khá cao.
2.4. TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME
Phần lớn các enzyme thủy phân dễ hòa tan trong nước nên có thể tách chiết enzyme từ canh trường nuôi cấy vi khuẩn bằng cách lọc hay ly tâm.
Để tinh sạch enzyme người ta thường dùng phương pháp kết tủa phân đoạn bằng dung môi hữu cơ hay các dung dịch muối trung tính (K.Clarkson và cộng sự, 2000).
Phương pháp tinh sạch enzyme được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là phương pháp tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (ethanol, isopropanol và aceton).
Tỷ lệ dung môi và dịch enzyme là một chỉ tiêu quan trọng, nếu thiếu dung môi sẽ không thu hồi hết enzyme trong dung dịch (Ngô Xuân Mạnh và cộng sự, 2005). Thông thường người ta thêm 3 – 4 thể tích dung môi vào 1 thể tích nước
chiết enzyme. Để tránh mất hoạt tính của enzyme, dung môi và enzyme phải được làm lạnh xuống 3 – 5o
C. Phương pháp này cho hiệu suất cao, ít ảnh hưởng đến hoạt
tính enzyme, dễ tách dung môi khỏi enzyme bằng cách sấy nhẹ. Có thể thu hồi dung môi bằng chưng cất. Phương pháp phổ biến thứ hai để tách enzyme là dùng muối trung tính để kết tủa. Muối trung tính thường dùng là (NH4)2SO4 với tỷ lệ 50 – 60 % so với dịch chiết enzyme (Lương Đức Phẩm, 1998).
2.5. DEXTRIN (theo tài liệu tổng hợp của Nguyễn Xuân Thủy, 2001)
Dextrin là sản phẩm được tạo thành do sự thủy phân tinh bột mà giá trị tương đương dextrose (DE) đạt được nhỏ hơn 20. Dextrin có công thức tổng quát giống với cacbonhydrate nhưng chiều dài chuỗi ngắn hơn và mức độ phức tạp cũng
thấp hơn.
2.5.1. Phân loại
Dextrin có thể ở dạng polymer mạch thẳng, phân nhánh hay polymer mạch vòng (cyclodextrin).
Dựa vào phương pháp xử lý người ta chia dextrin thành 4 nhóm chính:
Dextrin thu nhận dưới tác động của enzyme.
Các dextrin vòng Sardinger thu nhận dưới tác động của vi khuẩn Bacillus macerans lên tinh bột.
Các dextrin thu được bằng cách dùng acid để thủy phân tinh bột trong môi trường nước.
Các pirodextrin gồm các sản phẩm thu nhận được bằng xử lý nhiệt (có hay không có acid) lên tinh bột.
Dựa vào tính tan, người ta phân loại dextrin như sau (Lê Hồng Phú, 2000):
Amylosedextrin: tan trong rượu 25%, không tan trong rượu 40%
Erythrodextrin: tan trong rượu 70%, không tan trong cồn tuyệt đối.
Achrodextrin: tan trong cồn tuyệt đối.
2.5.2. Tính chất
Đặc tính của dextrin tùy thuộc vào chỉ số DE đạt được, thường có độ nhớt cao vì chứa một lượng lớn các polysaccharide trọng lượng lớn.
Dextrin có bản chất keo, nhưng mức phức tạp về phân tử thì lại thấp hơn.
Dextrin được xử lý enzyme tạo maltose, thủy giải bằng acid tạo glucose.
Cho nhiều màu sắc khác nhau với dung dịch Iod. Dextrin có mức độ phức tạp cao cho màu xanh hoặc đỏ tía. Các dextrin có mức độ phân tử trung bình cho màu đỏ và các dextrin có mức độ phân tử thấp hơn sẽ không tạo màu với Iod.
Dextrin tan trong nước tạo dung dịch trong như nước trái cây, nhưng khi có glycogen dung dịch dextrin sẽ có màu trắng đục.
2.5.2.1. Độ nhớt
Độ nhớt là một trong những yếu tố quan trọng trong ứng dụng của dextrin, lợi dụng độ nhớt này mà người ta sản xuất huyết tương trong y học.
Độ nhớt dextrin được đo bằng Sangtipuaz bởi các pipet chuyên dụng hoặc các công cụ chuẩn khác.
Độ nhớt phụ thuộc vào nguồn tinh bột, nhiệt độ, nồng độ acid, độ pH và tuổi của dung dịch.
2.6.2.2. Độ pH
pH ảnh hưởng đến dextrin thành phẩm, độ keo tụ và kết dính.
Trong quá trình thủy giải, độ acid làm biến đổi tinh bột hay dextrin phân tử lượng lớn tạo dung dịch loãng. Dù được trung hòa trở lại bằng Na2CO3 hoặc NH3 trước khi đóng gói, nhưng acid với một lượng dư vẫn ảnh hưởng tính keo trong quá trình tích lũy.
2.6.2.3. Tuổi của dung dịch dextrin
Sự gia tăng độ nhớt gây ra do sự đông lại hoặc do sự thoái biến của dung dịch dextrin, đặc biệt là những dextrin ít hòa tan.
Khi thêm vào dung dịch dextrin chất làm đông đặc (Tetraborate Natri 5 - 20%) thì độ nhớt của dextrin gia tăng, thêm các chất như urea, dicyandiamide, salisilic acid, formaldehyde, các muối guanadin sẽ làm giảm độ nhớt. Thêm urea có thể thích hợp để dung dịch dextrin ở trạng thái lỏng.
2.6.2.4. Độ hòa tan
Giai đoạn đầu của sự dextrin hóa, không có biến đổi lớn về độ tan của dextrin trong nước lạnh. Ở nhiệt độ 130 - 140o
C, khi có acid thì độ hòa tan nhanh
chóng đạt 100% nhưng hồ nóng từ sản phẩm này không bền và lúc làm lạnh thì
không tạo nên các gel đặc.
2.6.2.5. Màu sắc
Màu của dextrin phụ thuộc độ acid và nhiệt độ dextrin hóa.
Các sản phẩm thu được ở nhiệt độ thấp thường cho màu trắng, còn những sản phẩm thu được ở nhiệt độ cao có thể màu nâu. Độ acid cao ở một nhiệt độ nhất định thường làm sẫm màu sản phẩm do quá trình caramel hóa.
Có thể tẩy trắng dextrin với các peroxide hydrogen và bisulfite natri trong hệ thống acid hay peborat natri trong dung dịch kiềm.
2.5.4. Ứng dụng
Dextrin là sản phẩm trung gian giữa tinh bột và đường đơn hay đường đôi. Bản chất là đường nên chúng tương đối được cơ thể dễ hấp thu hơn tinh bột.
Dextrin được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp vì chúng không có độc tố và giá thành thấp. Được sử dụng như dịch keo có thể hòa tan trong nước như hồ dán, dùng làm tác nhân hóa dày trong chế biến thực phẩm và tác nhân kết dính
trong dược phẩm.
Đường malto-dextrin chủ yếu dùng làm thức ăn cho trẻ em, thực phẩm ăn kiêng với lượng nhỏ calo pha loãng (Janusz vaf Anna, 2004), làm chất thơm hay màu thực phẩm, dùng trong công nghiệp dược phẩm.
Một số dextrin được sử dụng thay thế cho chất béo trong các sản phẩm như bơ và mỡ gầy.
Trong công nghiệp rượu bia, dextrin được đưa vào để ổn định lượng dextrin trong sản phẩm, vừa là cơ chất cho quá trình lên men vừa tăng chất lượng, tạo cảm quan tốt cho sản phẩm.
Trong y học, dextrin được pha chế với glucose 5%, NaCl 9‰ hay sorbitol 5% tạo dung dịch huyết tương, dung dịch này dùng để chữa trị cho bệnh nhân mất máu nhiều (Lê Hồng Phú, 2000).
Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN
Khóa luận được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh hóa trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh.
Thời gian tiến hành: từ 19/03/2007 đến 19/07/2007.
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Nguồn gốc vi khuẩn
Giống vi khuẩn Bacillus subtilis do công ty TNHH Gia Tường cung cấp.
Nguyên liệu
- Cám bắp, bã đậu nành, bột năng Vĩnh Thuận, bột nếp Vĩnh Thuận, bột gạo Vĩnh Thuận, bột bắp Tài Ký.
Thiết bị và dụng cụ
- Cân điện tử - Pipet
- Tủ lạnh - Micropipet
- Bể điều nhiệt - Bercher
- Nồi hấp - Erlen
- Tủ sấy - Bình định mức
- Máy ly tâm - Ống đong
- Máy đo mật độ quang - Khay nhựa…
Hóa chất
- Cồn 96% - Iod
- NaCl - HCl
- NaOH - Na2HPO4
- (NH4)2SO4 - NaH2PO4 …
Các loại môi trường
Môi trường giữ giống (môi trường nước chiết giá đậu đường pepton agar).
Môi trường nhân giống (môi trường nước chiết giá đậu đường pepton).
Môi trường nuôi cấy bán rắn.
Thành phần và tỷ lệ các loại môi trường được trình bày chi tiết ở mục 1 phần phụ lục.
3.3. PHưƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.3.1. Xác định mật độ tế bào Bacillus subtilis trong dịch tăng sinh
Cách tiến hành:
Dùng que cấy vòng cấy chuyển 1 vòng vi khuẩn B. subtilis từ ống giống vào erlen chứa 20 ml môi trường tăng sinh đã khử trùng, lắc đều và đặt trên máy lắc (120 - 180 vòng/phút).
Sau 24 giờ kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn trong dịch tăng sinh bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (được trình bày ở mục 2.1 và 2.2 của phần phụ lục).
3.3.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy tối ưu
Môi trường nuôi cấy bán rắn (35 g/erlen) được khử trùng ở 1atm trong 45 phút và để nguội khoảng 40 - 50o C. Cấy 5% dịch vi khuẩn đã tăng sinh 24 giờ vào
môi trường nuôi cấy. Ủ ở nhiệt độ phòng (30 – 32o
C), trong thời gian 24, 36, 48, 60
và 72 giờ. Canh trường sau khi nuôi cấy được sấy khô ở 50o
C.
Cân 1 g canh trường đã sấy khô hòa trong 100 ml nước cất, đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút ta có dịch enzyme pha loãng 100 lần. Từ dịch pha loãng này tiếp tục pha loãng đến độ pha loãng thích hợp để xác định hoạt tính α-amylase theo phương pháp Heinkel (xem mục 2.5 phần phụ lục).
3.3.3. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96%
Trong thí nghiệm này dùng phương pháp tủa enzyme bằng cồn 96% lạnh.
Cân 5 g canh trường đã sấy khô và nghiền nhỏ hòa trong 80 ml nước cất, lắc đều trong 15 phút. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch chiết enzyme.
Hoạt độ α-amylase sau tủa
Lượng protein sau tủa
Lấy 10 ml dịch chiết enzyme trên đem tủa với cồn 96% đã để lạnh khoảng 4o C theo các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 và 1:5, lắc đều, để lạnh trong 15 phút rồi lấy ra đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ cồn, thu cặn lắng và hòa trong 5 ml đệm acetate pH = 5,0. Định mức với nước cất thành 100 ml.
Hút 1 ml dịch enzyme này đem định lượng protein theo phương pháp Lowry (xem mục 2.6 phần phụ lục) và xác định hoạt tính theo phương pháp Heinkel.
......
3.3.4. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng (NH4)2SO4
Tương tự, chuẩn bị dịch chiết enzyme từ canh trường giống như phần tủa bằng cồn 96%.
Cân chính xác lượng muối (NH4)2SO4 (xem mục 2.6 phần phụ lục). Cho từ từ vào các erlen chứa 10 ml dịch enzyme đã để lạnh, lắc đều trong 10 phút. Sau đó đem để lạnh. Sau 10 phút, đem ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút. Các bước kế tiếp tiến hành giống như phần tủa bằng cồn 96%.
3.3.5. Khảo sát thời gian tủa cồn 96%
Các bước tiến hành giống như phần khảo sát tỷ lệ cồn, nhưng thể tích cồn ở thí nghiệm này không thay đổi. Tỷ lệ cồn 96% và enzyme là tỷ lệ thích hợp đã xác định được ở mục 3.3.3.
Kiểm tra hoạt tính α-amylase và định lượng protein với thời gian tủa là 15, 30, 45, 60 và 75 phút.
Hoạt độ α-amylase trước tủa
Lượng protein sau tủa
3.3.6. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng năng thủy phân tinh bột của chế phẩm α-amylase
3.3.6.1. Nhiệt độ phản ứng
Cân 0,03 g chế phẩm α-amylase tinh sạch sơ bộ bằng cồn 96% đã sấy khô hòa trong 50 ml nước cất, pha loãng thêm 100 lần. Đo hoạt tính α-amylase theo phương pháp Heinkel ở các giá trị nhiệt độ: 30, 40, 45, 50, 55, 60 và 65o C.
3.3.6.2. pH
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các giá trị pH: 5,8; 6,0; 6,2; 6,4 và 6,6 lên hoạt độ α-amylase ở nhiệt độ thích hợp.
Kiểm tra hoạt tính α-amylase ở mỗi giá trị pH theo phương pháp Heinkel.
3.3.7. Khảo sát tỷ lệ cồn 96% thích hợp để thu dextrin
Tinh bột sau khi hồ hóa được để nguội đến nhiệt độ thích hợp và cho chế phẩm enzyme (CPE) đã pha loãng vào (xem mục 2.7 phần phụ lục). Sau 30 phút đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ tinh bột thừa.
Dịch ly tâm được cho vào các erlen có chứa cồn theo các tỷ lệ 1:2, 1:3 và 1:4, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, loại dịch cồn và cân lượng dextrin thu được.
3.3.8. Khảo sát khả năng thủy phân tinh bột của chế phẩm α-amylase
3.3.8.1. Khảo sát khả năng thủy phân với các nguồn tinh bột
Thực hiện phản ứng thủy phân với các nguồn tinh bột khác nhau: bột gạo, bột năng, bột nếp, bột bắp ở nồng độ 10%.
Tiến hành: 2 g tinh bột được hồ hóa trong 18 ml dung dịch đệm ở giá trị pH tối ưu; làm nguội đến nhiệt độ thích hợp và cho vào 0,5 ml chế phẩm α-amylase đã pha loãng 200, 400, 600 lần, khuấy đều, liên tục.
Sau 10 phút, cho 5 ml HCl 5% để dừng phản ứng. Ly tâm loại bỏ tinh bột thừa, dịch ly tâm được tủa cồn để thu dextrin. Cân lượng dextrin tạo thành và so sánh khối lượng dextrin có được giữa các nguồn tinh bột.
.......
3.3.8.2. Khảo sát nồng độ tinh bột thích hợp
Sau khi chọn được nguồn tinh bột thích hợp, tiến hành khảo sát lượng dextrin tạo thành ở các nồng độ tinh bột là 10%, 15% và 20%.
Cho thể tích và độ pha loãng CPE thích hợp vào 20 g hồ tinh bột với nồng độ tinh bột 10% và 15% và 20%. Thời gian khảo sát là 10, 20, 30 và 40 phút.
..........
MỤC LỤC
Chương 1. MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
1.2. MỤC ĐÍCH
1.3. YÊU CẦU
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. BACILLUS SUBTILI
2.1.1. Đặc điểm vi khuẩn
2.1.2. Phân loại
2.1.3. Bộ gen
2.1.4. Ứng dụng
2.2. ALPHA-AMYLASE
2.2.1. Khái niệm
2.2.2. Phân loại, danh pháp
2.2.3. Cấu trúc phân tử
2.2.4. Tính chất
2.2.5. Cơ chế xúc tác
2.2.6. Ứng dụng
2.3. CÁC PHưƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT
2.3.1. Nuôi cấy bề mặt
2.3.2. Nuôi cấy chìm
2.4. TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME
2.5. DEXTRIN
2.5.1. Phân loại
2.5.2. Tính chất
2.5.2.1. Độ nhớt
2.5.2.2. Độ pH
2.5.2.3. Tuổi của dung dịch dextrin
2.5.2.4. Độ hòa tan
2.5.2.5. Màu sắc
2.5.3. Quy trình sản xuất dextrin
2.5.4. Ứng dụng Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.3. PHưƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.3.1. Xác định mật độ tế bào
3.3.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy thích hợp
3.3.3. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96%
3.3.4. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng (NH4)2SO4
3.3.5. Khảo sát thời gian tủa enzyme bằng cồn 96%
3.3.6. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của α-amylase
3.3.6.1. Nhiệt độ
3.3.6.2. pH
3.3.7. Khảo sát tỷ lệ cồn thích hợp thu dextrin
3.3.8. Khảo sát khả năng thủy phân của chế phẩm α-amylase với các nguồn tinh bột.
3.3.8.1. Khảo sát khả năng thủy phân với các nguồn tinh bột
3.3.8.2. Khảo sát nồng độ tinh bột thích hợp.
3.4. PHưƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN NUÔI CẤY
4.2. KẾT QUẢ TINH SẠCH α-AMYLASE BẰNG CỒN 96% VÀ (NH4)2SO4
4.2.1. Kết quả tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96%
4.2.2. Kết quả tỷ lệ tủa enzyme bằng (NH4)2SO4
4.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN TỦA ENZYME BẰNG CỒN 96%
4.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HưỞNG ĐẾN KHẢ
NĂNG THỦY PHÂN CỦA α-AMYLASE
4.4.1. Nhiệt độ
4.4.2. pH
4.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỶ LỆ CỒN THÍCH HỢP THU DEXTRIN
4.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA CHẾ PHẨM α-AMYLASE VỚI CÁC NGUỒN TINH BỘT
4.7. KẾT QUẢ KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ BỘT NĂNG VÀ THỜI GIAN THỦY PHÂN HỒ BỘT NĂNG BẰNG CHẾ PHẨM α-AMYLASE
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO